T4 DNA Ligase xúc tác sự hình thành liên kết phosphodiester giữa 5'-phosphate và 3'-hydroxyl termini trong DNA hoặc RNA song công. Enzyme này sẽ tham gia vào các termini đầu cuối cùn và kết dính cũng như sửa chữa các lỗ sợi đơn trong các tế bào lai DNA, RNA hoặc DNA-RNA song công